三光子成像

什么是三光子显微镜？

三光子显微镜是一种荧光显微镜技术，与两光子显微镜相比，荧光团几乎同时吸收三个光子。这些激发光子具有更长的波长和较低的能量，该波长比在单一或两光子激发显微镜中激发相同荧光团的光子具有更低的能量。

研究人员如何从使用三光子显微镜中受益？

两光子激发显微镜促进了生命科学研究中的基本发现。不幸的是，两光子技术受到了一些局限性。具体而言，当成像在500 µm以下时，背景信号会增加，并且对比度减少 - 使得无法解析结构或生理活性。相反，三光子激发显微镜中激发光的物理特性可提供更深的成像，并具有优越的激发限制，从而比两光子显微镜提供了更好的对比度和信噪比（SBR）。

三光子显微镜的局限性是什么？

三光子成像的普及的主要障碍是预测在长波长窗口处的吸水率增加，因为这种效果可能导致样品过热。但是，研究人员发现，三光子成像的最佳波长是1300 nm和1700 nm窗户中吸收和散射之间的权衡。具体而言，吸收吸收量增加了2倍，但在1300 nm处的散射速度也减少了几乎2倍，因此，成像需要使用较少的激光功率。这表明，有足够的空间可以容纳研究目标，同时遵守三光子显微镜的物理限制。三光子成像的便利性进一步平衡了这些限制，因为在两光子显微镜中使用的许多常见指标可以轻松地重新置于三光子成像中。

考虑适用于三光子成像的特殊激光源和成像镜头的成本也很重要。通常，此应用程序需要两个激光器。为了增加三光子吸收的概率，研究人员必须使用具有高光子密度的光源。最常见的方法是基于泵送光学参数放大器（OPA）的高功率激光器，该激光器从飞秒激光器中取出一个波长，并将其变成两个不同波长的光。所得的光束，称为惰轮，显示出比初始泵送激光器更长的波长，非常适合三光子成像。OPA是低重复激光器（〜1-4 MHz），由于这种特征性，不允许以30 Hz速度的谐振扫描仪成像。典型的成像率小于10 Hz，并且视野较小，这可以随着激光技术的发展而改善。