Three-Photon成像

什么是三光子显微镜?

三光子显微镜是一种荧光显微镜技术，与双光子显微镜相比，荧光团几乎同时吸收三个光子。与单光子或双光子激发显微镜中用来激发相同荧光团的光子相比，这些激发光子具有更长的波长和更低的能量。

研究人员如何从使用三光子显微镜中获益?

双光子激发显微镜促进了生命科学研究的基础性发现。不幸的是，双光子技术存在一些局限性。具体来说，当在500 μ m及以下成像时，背景信号增加，对比度降低，这使得它无法分辨结构或生理活动。相反，在三光子激发显微镜中激发光的物理特性提供了更深刻的成像，并具有更好的激励约束，因此比双光子显微镜提供了更好的对比度和信本比(SBR)。

三光子显微镜的局限性是什么?

三光子成像普及的主要障碍是预测在长波长窗口的吸水率增加，因为这种效应可能导致样品过热。然而，研究人员发现，三光子成像的最佳波长是在1300 nm和1700 nm窗口的吸收和散射之间的权衡。具体来说，在1300纳米处，吸收增加了2倍，但散射也减少了近2倍，因此成像所需的激光功率更少。这表明，在符合三光子显微镜的物理约束条件的同时，有足够的空间来容纳研究目标。三光子成像的便利性进一步平衡了这些限制，因为双光子显微镜中使用的许多常见指标可以很容易地用于三光子成像。

同样重要的是要考虑适合三光子成像的特殊激光源和成像透镜的成本。通常，这种应用需要两个激光器。为了增加三光子吸收的概率，研究人员必须使用光子密度高的光源。最常见的方法是基于高功率激光泵浦光参量放大器(OPA)，它从飞秒激光中获取一种波长的光，并将其转化为两种不同波长的光。产生的光束被称为惰流光束，它比初始抽运激光具有更长的波长，是三光子成像的理想选择。OPA是一种低重复激光(~1-4 MHz)，由于这一特性，不允许在30赫兹的速度下用共振扫描仪成像。典型的成像速率小于10hz，视场较小，随着激光技术的进步，这一点可以得到改善。