拉曼显微术指南
Ramn显微镜基本原理
什么是拉曼显微镜?
关于拉曼显微镜
拉曼显微镜(Raman microscopy -µ-Raman)是传统光学显微镜和独特的拉曼光谱化学鉴定相结合的产物。
这两种技术本身都相当强大，但当它们结合起来时，它们提供了化学检查最小物体(bb0 0.5 μ m)的可能性，因此，它们将光谱与空间信息联系起来。
与红外显微镜相比，拉曼显微镜更容易内爆，因为它们使用的光与简单的玻璃光学兼容。因此，拉曼显微镜通常是在高质量光学显微镜的基础上发展起来的。
关于抽样和共聚焦
通常，根据分析任务的不同，在拉曼显微镜中不需要精心的样品制备。通常，样品被放置在显微镜下。至多，横截面准备或大的工件切割尺寸以适合在舞台上。
然而，与拉曼光谱相同的样品限制仍然适用，样品可能不显示强烈的荧光或激发波长的吸光度。
有些样品需要共聚焦拉曼显微镜，它提供所有三维的空间分辨率。通过这种方法，您可以测量容器内部(例如玻璃小瓶)或在3D中描述样品。
校准拉曼显微镜
为了得到精确可靠的喇曼µ-Raman结果，波长轴的精确标定是必不可少的。拉曼显微镜的许多操作变化通常或多或少会对波数校准产生严重的影响。
(重新)校准是通过测量硅标准来进行的，但现代显微镜提供了最大限度的方便的连续校准。
如果不能连续校准，则应定期进行再校准，甚至在激光、孔径或光栅变化、突然冲击和振动以及温度变化等看似较小的仪器调整之后也应进行再校准，以确保最佳的光谱数据。
什么是光谱分辨率?什么是空间分辨率?
光谱分辨率描述将光谱特征分解为单个元素的能力。如果它太小，一些光谱信号就会消失在较宽的“波段”中。
如果它太大，测量所需的时间将远远超过所需的时间，而对用户没有任何好处。因此，了解哪种光谱分辨率对于特定的样品是理想的是很重要的。是什么使分辨率“太低”还是“太高”取决于各自的应用程序和手头的分析任务。
空间分辨率很重要，因为它影响我们看物体的锐利程度。在拉曼显微镜中，区分样品中的不同结构是至关重要的。因此，空间分辨率越高，获得的信息就越详细。
横向和轴向分辨率由各种参数决定。为了达到这两个区域的最高分辨率，必须使用共聚焦拉曼显微镜。通常，空间分辨率是拉曼成像的一个决定性参数。
Confocality是什么?为什么这对拉曼这么重要?
在光学显微镜中，共焦性是指被照亮的样品光斑和光束路径内的针孔孔径共用同一个焦点。实际上，不是整个样本，而是只有一小部分被点形光源照亮。针孔会阻挡未聚焦的光，从而增加对比度和景深。
什么是共聚焦拉曼显微镜?
该原理可应用于拉曼光谱，从而提高沿x、y轴(横向)和z轴(深度)的空间分辨率，同时实现深度剖面。然而，拉曼显微镜的共焦设计可能有所不同。
真正的共焦设计
真正的共聚焦拉曼显微镜的最大优点是空间和光谱分辨率的独立控制。这是通过在光谱仪入口狭缝的前面放置一个针孔孔径来实现的。不同的针孔孔径控制共焦程度，而入口狭缝控制光谱仪的光谱分辨率。这种设计的缺点是在试图保持两个光圈理想对齐以保持最佳性能时遇到的困难。
Pseudo-confocal设计
在简化的结构中，空间分辨率可以由入口狭缝在一个方向上和CCD探测器在正交方向上的空间分辨率组合来控制。当涉及到空间分辨率时，光谱仪的局限性导致了较差的性能，但通过减少伪共焦设置中的光学数量，整体吞吐量大大提高。
Hybrid-confocal设计(FlexFocus)
由于高槽和真正的共聚焦设计都具有明显的优势，拉曼显微镜可以配备一个混合孔径阵列，其中包含一组针孔和缝，可作为共聚焦孔径和摄谱仪入口。这种混合设计结合了两种设计的优点，并允许按需访问真正的共焦或高吞吐量设置。
拉曼显微镜常见问题解答
关于拉曼显微镜的常见问题
拉曼光谱的优点是什么
与FTIR和NIR吸收等其他振动光谱技术相比，拉曼具有几个主要的优势。与吸收相反，拉曼效应是光在样品上的非弹性散射。因此，拉曼光谱在测量固体、液体和气体时不需要或很少需要样品制备。不仅直接，还可以通过玻璃和塑料等透明窗户。水的拉曼信号很低，因此拉曼光谱可以很容易地检测到溶解在水中的化合物，而不会有很强的干扰。这使得拉曼光谱非常适用于原生状态的生物样品。
获取拉曼光谱需要多长时间?
曝光时间取决于许多因素，如光谱质量的期望、激光功率和拉曼散射的样品截面。通常，高质量的拉曼光谱可以在几秒钟内获得。
从混合材料中可以得到拉曼光谱吗?
拉曼光谱包含了所有被测分子的信息。因此，从混合物中得到的拉曼光谱包含了各种分子的峰。如果组分的光谱是已知的，就可以产生有关组分的定量信息。
除了化学结构，拉曼还能探测到什么信息?
拉曼光谱可以直接或间接地提供各种信息，如分子中的同位素、同素异形体、结晶度、多态性、晶格中的掺杂、张力、压力和温度。
拉曼光谱学是定量的吗?
光谱的强度与浓度成线性关系。峰值强度和浓度之间的关系可以用已知的样品进行校准。在混合物中，拉曼峰同时提供了化合物浓度的定量信息。
适合我的应用的最佳激光波长是什么?
不幸的是，用于特定应用的最佳激光波长也并不总是显而易见的。在拉曼光谱实验中，优化激发波长需要考虑多种系统变量。散射效率、荧光的影响、探测器效率，以及成本效益和易于使用的系统的可用性，是需要考虑的主要方面。最常用的波长是785 nm和/或523 nm。532纳米特别适合于无机材料，如石墨烯和富勒烯。
拉曼测量的典型激光功率是多少?
拉曼显微镜上样品的激光功率通常从亚毫瓦到几十毫瓦。拉曼强度与激光功率成正比。然而，当使用强激光功率时，样品损坏的风险会增加。可以降低激光功率以避免样品损坏，但这样做我们需要更长的曝光时间来获得高质量的光谱。
